迄今，由 RNA 引导的 CRISPR-Cas 系统已经有十多年的发展历史。期间，有许多新的技术被开发出来，并被用于生物学和医学等领域的研究中，比如，了解疾病的遗传基础、通过编程逆转疾病状态的工程细胞治疗等。
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在此基础上，为了进一步落实基因组编辑技术在基础研究、细胞工程和基因治疗等领域的应用，相关领域的研究人员正在紧锣密鼓地开发更好的方法，希望能将 CRISPR-Cas 系统更有效地递送至原代细胞。
虽然已经有许多种（病毒载体、电穿孔和小分子药物等）CRISPR-Cas 系统的递送方法，但这些方法各自都存在着局限性。
具体来说，如果采用病毒式方法，病毒会不可避免地被整合到人的基因组，且会永远和人类的细胞一同存在，这会导致诸多安全问题。比如，若病毒载入的位点影响人类的抑癌基因，可能导致细胞发展为癌细胞；若病毒插入的位点不适合基因的表达，会造成低效率的基因编辑。并且，这种方法对载体的大小也有限制，无法包裹那些较大的载体。
如果采用电穿孔法，即先通过高电压击穿细胞膜，再将 CRISPR 的载体导入细胞中，会给细胞的活力和激活状态造成损伤。如果采用小分子化学药物包裹 mRNA 的方法，将载体递送到细胞中，会造成较高的生产成本，以及在细胞水平的表达量不统一，且 mRNA 也非常不稳定。
“要是我们能开发出一种方法，可以不用病毒、电击、mRNA，而是只用蛋白来实现基因编辑，就极大可能弥补当前那些传统方法存在的缺陷。”美国宾夕法尼亚大学史俊炜副教授表示。
图丨史俊炜（来源：史俊炜）
基于上述设想，他和团队设计了一套多肽辅助的纯蛋白基因组编辑（Peptide-Assisted Genome Editing，PAGE）的 CRISPR-Cas 系统（以下简称为 CRISPR-PAGE 系统），在方便、高效、无毒性的条件下，实现了对原代细胞的基因组编辑。研究结果显示，该系统在小鼠和人类原代 T 细胞中，能够实现高达 98% 的编辑效率；在人类原代造血干细胞和祖细胞中，则能够实现接近 100% 的基因编辑效率。
图丨CRISPR-PAGE 系统的开发（来源：Nature Biotechnology）
值得一提的是，CRISPR-PAGE 系统由穿透细胞的 Cas 蛋白和穿透细胞的核内体逃逸肽组成，只需 30 分钟的孵育期，就能在将细胞毒性和基因转录干扰降至最低的同时，实现强大的单基因组和多基因组编辑。
那么，具体来说，单基因组和多基因组编辑究竟是如何实现的呢？
“由于细胞膜和核膜都由脂类组成且带负电，因此我们就想，如果能在 CRISPR 蛋白的表面修饰足够多的正电或亲脂疏水性基团，这个 CRISPR 蛋白就会直接融合且穿透细胞膜和核膜，进而实现基因编辑。并且，在该方法中，蛋白和细胞之间是共孵育的，所以要实现单基因或多基因，只用孵育不同的蛋白即可。”史俊炜解释道。
同时，他也强调，该方法最大的应用意义在于，CRISPR-PAGE 系统是基于细菌生产，生产成本低、状态稳定、易于运输，同时也容易实现基因编辑，且编辑完后不留任何痕迹，也就是原代细胞里剩下的 CRISPR 的所有系统，会在两天之内完全清除。
2023 年 4 月 24 日，相关论文以《利用肽辅助基因组编辑的人类和小鼠原代细胞高效工程》（Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing）为题在 Nature Biotechnology 上发表[1]。
图丨相关论文（来源：Nature Biotechnology）
宾夕法尼亚大学博士后研究员张珍为该论文的第一作者，宾夕法尼亚大学免疫学研究所所长 E·约翰·惠里（E. John Wherry）、宾夕法尼亚大学表观遗传学所长雪莱·L·伯杰（Shelley L. Berger）教授和史俊炜副教授担任论文的共同通讯作者。
在这项研究中，该团队主要把 CRISPR-PAGE 系统用于人类的 T 细胞和血液干细胞中。事实上，包括巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等在内的许多来自血液的细胞，都可以通过该系统实现基因编辑。
并且，如上所述，该方法是让带正电或带亲脂疏水基团的 CRISPR，通过带负电的细胞膜和核膜，遵循了基因正负电相互作用和脂类融合的原则，因此能为原代细胞的下一代基因工程，提供广泛通用的平台。
此外，该方法虽然已经实现了单基因或多基因敲除，但未来的基因编辑或细胞治疗方法，还要求能够达到单点突变、多点突变或整个基因的更换。因此，该团队后续也计划对该方法进行进一步的升级。
“虽然我们研究的这个方法是基于 CRISPR 的基因改造，但只要能够找到合适的表面带正电或具有亲脂疏水性的结构，其还能用于其他大分子或基于蛋白质的治疗递送，并有助于更多潜在治疗方法的开发。”史俊炜表示。
参考资料：
1. Zhang, Z., Baxter, A.E., Ren, D. et al. Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing. Nature Biotechnology (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01756-1
